Protocolos: Genotipificación de SNP sin electroforesis en arroz y otras especies vegetales

Protocolo: Método simple sin geles de electroforesis para genotipificación de SNP utilizando primers de alelos específicos en arroz y otras especies vegetales.

Naoki Hirotsu1,2, Naomi Murakami1, Takayuki Kashiwagi1,3, Kazuhiro Ujiie1 y Ken Ishimaru1

1Division of Plant Sciences, National Institute of Agrobiological Sciences,
2Current address: Department of Life Sciences, Faculty of Life Sciences, Toyo University
3Current address: Department of Bioproductive Science, Faculty of Agriculture, Utsunomiya University


Publicado en: Plant Methods, 6:12: 2010

RESUMEN EN INGLES

Genotype analysis using multiple single nucleotide polymorphisms (SNPs) is a useful but labor-intensive or high-cost procedure in plant research. Here we describe an alternative genotyping method that is suited to multisample or multi-locus SNP genotyping and does not require electrophoresis or specialized equipment.
Results: We have developed a simple method for multi-sample or multi-locus SNP genotyping using allele-specific primers (ASP). More specifically, we (1) improved the design of allele-specific primers, (2) established a method to detect PCR products optically without electrophoresis, and (3) standardized PCR conditions for parallel genomic assay
using various allele-specific primers. As an illustration of multi-sample SNP genotyping using ASP, we mapped the locus for lodging resistance in a typhoon (lrt5). Additionally, we successfully tested multi-locus ASP-PCR analysis using 96 SNPs located throughout the genomes of rice (Oryza sativa) cultivars 'Koshihikari' and 'Kasalath', and demonstrated
its applicability to other diverse cultivars/subspecies, including wild rice (O. rufipogon).
Conclusion: Our ASP methodology allows characterization of SNPs genotypes without electrophoresis, expensive probes or specialized equipment, and is highly versatile due to the flexibility in the design of primers. The method could be established easily in any molecular biology laboratory, and is applicable to diverse organisms.

RESUMEN EN ESPAÑOL
Antecedentes: El análisis de genotipos utilizando polimorfismos de una sola base (SNPs) es un procedimiento útil pero muy costoso y difícil de realizar. En éste trabajo describiremos un método de genotipificación alternativo aplicable a genotipificación SNP multilocus y para numerosas muestras que no requiere electroforesis ni equipamiento especializado. Resultados: Desarrollamos un método simple para genotipificación de SNP multilocus y para numerosas muestras utilizando cebadores (primers) para alelos específicos (ASP). Mas concretamente; (1) mejoramos el diseño de primers específicos para alelos, (2) establecimos un método de detección óptico para productos de PCR sin electroforesis, y (3) estandarizamos las condiciones de PCR para igualar una prueba genómica utilizando varios primers para alelos específicos . Para ilustrar la genotipificación SNP en numerosas muestras utilizando ASP, realizamos un mapeo del locus para Irt5. Adicionalmente evaluamos con éxito el análisis de ASP-PCR multi locus utilizando 96 SNPs localizados en el genoma de cultivares de arroz (Oryza sativa) 'Koshihikari' y 'Kasalath', y demostramos que es aplicable a diferentes cultivares/subespecies entre las que se incluyen el arroz salvaje (O. rufipogon).Conclusión. Nuestra metodología ASP permite la caracterización de genotipos SNP sin la necesidad de realizar costosas pruebas de electroforesis ni de contar con equipamiento especializado y además es altamente versátil debido a la flexibilidad en el diseño de primers. El método puede ser realizado en cualquier laboratorio de biología molecular, y es aplicable a diferentes organismos.