viernes, 14 de enero de 2011

Protocolos: Genotipificación de SNP sin electroforesis en arroz y otras especies vegetales

Protocolo: Método simple sin geles de electroforesis para genotipificación de SNP utilizando primers de alelos específicos en arroz y otras especies vegetales.

Naoki Hirotsu1,2, Naomi Murakami1, Takayuki Kashiwagi1,3, Kazuhiro Ujiie1 y Ken Ishimaru1

1Division of Plant Sciences, National Institute of Agrobiological Sciences,
2Current address: Department of Life Sciences, Faculty of Life Sciences, Toyo University
3Current address: Department of Bioproductive Science, Faculty of Agriculture, Utsunomiya University


Publicado en: Plant Methods, 6:12: 2010

RESUMEN EN INGLES

Genotype analysis using multiple single nucleotide polymorphisms (SNPs) is a useful but labor-intensive or high-cost procedure in plant research. Here we describe an alternative genotyping method that is suited to multisample or multi-locus SNP genotyping and does not require electrophoresis or specialized equipment.
Results: We have developed a simple method for multi-sample or multi-locus SNP genotyping using allele-specific primers (ASP). More specifically, we (1) improved the design of allele-specific primers, (2) established a method to detect PCR products optically without electrophoresis, and (3) standardized PCR conditions for parallel genomic assay
using various allele-specific primers. As an illustration of multi-sample SNP genotyping using ASP, we mapped the locus for lodging resistance in a typhoon (lrt5). Additionally, we successfully tested multi-locus ASP-PCR analysis using 96 SNPs located throughout the genomes of rice (Oryza sativa) cultivars 'Koshihikari' and 'Kasalath', and demonstrated
its applicability to other diverse cultivars/subspecies, including wild rice (O. rufipogon).
Conclusion: Our ASP methodology allows characterization of SNPs genotypes without electrophoresis, expensive probes or specialized equipment, and is highly versatile due to the flexibility in the design of primers. The method could be established easily in any molecular biology laboratory, and is applicable to diverse organisms.

RESUMEN EN ESPAÑOL
Antecedentes: El análisis de genotipos utilizando polimorfismos de una sola base (SNPs) es un procedimiento útil pero muy costoso y difícil de realizar. En éste trabajo describiremos un método de genotipificación alternativo aplicable a genotipificación SNP multilocus y para numerosas muestras que no requiere electroforesis ni equipamiento especializado. Resultados: Desarrollamos un método simple para genotipificación de SNP multilocus y para numerosas muestras utilizando cebadores (primers) para alelos específicos (ASP). Mas concretamente; (1) mejoramos el diseño de primers específicos para alelos, (2) establecimos un método de detección óptico para productos de PCR sin electroforesis, y (3) estandarizamos las condiciones de PCR para igualar una prueba genómica utilizando varios primers para alelos específicos . Para ilustrar la genotipificación SNP en numerosas muestras utilizando ASP, realizamos un mapeo del locus para Irt5. Adicionalmente evaluamos con éxito el análisis de ASP-PCR multi locus utilizando 96 SNPs localizados en el genoma de cultivares de arroz (Oryza sativa) 'Koshihikari' y 'Kasalath', y demostramos que es aplicable a diferentes cultivares/subespecies entre las que se incluyen el arroz salvaje (O. rufipogon).Conclusión. Nuestra metodología ASP permite la caracterización de genotipos SNP sin la necesidad de realizar costosas pruebas de electroforesis ni de contar con equipamiento especializado y además es altamente versátil debido a la flexibilidad en el diseño de primers. El método puede ser realizado en cualquier laboratorio de biología molecular, y es aplicable a diferentes organismos.

miércoles, 12 de enero de 2011

Medicina Veterninaria: Anemia hemolítica autoinmune en cerdos

Anticuerpos Anti-actina en la anemia hemolítica autoinmune

Kathrin M Felder1, Katharina Hoelzle1, Karl Heinritzi2, Mathias Ritzmann3, Ludwig E Hoelzle1

1Institute of Veterinary Bacteriology, Vetsuisse Faculty, University of Zurich, Switzerland.
2Clinic for Swine, Ludwig-Maximilians-University Munich, Munich, Germany.
3Clinic for Swine, University for Veterinary Medicine, Vienna, Austria.


Resumen


Antecedentes: En la anemia hemolítica de origen autoinmune (AIHA), los anticuerpos auto- reactivos dirigidos contra los glóbulos rojos están bajo regulación por incremento, lo que produce la muerte de los eritrocitos. Las infecciones provocadas por Mycoplasma suis en los cerdos inducen AIHA tanto de tipo caliente como de tipo frío. El objetivo de este estudio fue identificar los auto-antígenos blanco de los anticuerpos IgG auto-reactivos para el tipo caliente.
Se determinó la auto-reactividad en el suero de cerdos infectados experimentalmente con M. suis.
Resultados: Se encontraron anticuerpos anti-actina en el suero del 95% de los animales analizados. La reactividad era específica de especie, es decir la reactividad con la actina porcina era significativamente mayor que con la actina de conejo. El suero de los animales previamente inmunizados con la proteína de adhesión MSG1 de M. suis, presentó reactividad con la actina antes de la infección con M. suis lo que indica que la imitación molecular participa en el mecanismo auto reacción específico. Se descubrió un posible epitope de reacción cruzada.
Conclusiones: Éste es el primer informe de anticuerpos anti-actina auto-reactivos involucrados en la patogénesis de la anemia hemolítica autoinmune.

Medicina Veterinaria: Células madre e ingeniería de tejidos en equinos

Medicina regenerativa actual y futura: Principios, conceptos y uso terapéutico de terapia de células madre e ingeniería de tejidos en medicina equinaAutores:


Thomas G. Koch, Lise C. Berg, Dean H. Betts
Department of Biomedical Sciences, University of Guelph, Guelph, Ontario N1G 2W1 (Koch, Betts); Department of Basic Animal and Veterinary Sciences, Faculty of Life Sciences, University of Copenhagen, Grønnegårdsvej 7, 1870 Frederiksberg C, Denmark (Koch, Berg).

Publicado en: Can Vet J ;50:155–165 2009
Año de Publicación: 2009

Resumen
Este trabajo brinda una perspectiva general de los principios generales de la terapia con células madre e ingeniería de los tejidos; relacionamos el conocimiento comparativo en el área, con el estado actual y futuro de la medicina regenerativa en los equinos.
Los conocimientos existentes en la actualidad sobre la biología de células madre, factores bioquímicos y andamiajes y del potencial uso terapéutico de los mismos en equinos, son preliminares. En los últimos años, se ha proclamado el aislamiento de células madre mesenquimáticas de diferentes tejidos de equinos. Sobre la base de los criterios de la Sociedad Internacional para la Terapia Celular, la mayoría de éstas células se denominan mas adecuadamente, células mesenquimales estromales multipotentes, dado que existen pruebas de que presentan in vivo las características fundamentales de pluripotencia y la capacidad de auto-regeneración. Esto significa que estas células de diferentes tejidos representan una promesa para el empleo terapéutico en caballos. Los tres componentes de la ingeniería de los tejidos, células, factores biolquímicos y biomateriales, son cada vez mas aplicados en la medicina equina, abastecidos por mejores andamiajes (soportes) y mejores conocimientos sobre los factores bioquímicos individuales y recursos celulares.
La efectividad de las terapias basadas en células madre y la mayoría de los conceptos sobre ingeniería de tejidos, no han sido demostrados de manera contundente en estudios clínicos controlados realizados en equinos, como para ser considerada medicina basada en evidencia. Mientras tanto, el mantra médico “no dañar” debe prevalecer, y la aplicación de las terapias basadas en células madre en el caballo deben ser practicadas críticamente y con precaución y los resultados del tratamiento (buenos o malos) deben ser registrados e informados.
La investigación sobre células madre e ingeniería de los tejidos en caballos tiene interesantes perspectivas comparativas y específicas de los caballos, que muy probablemente beneficiarán la salud de los caballos y de los humanos. Se necesitan estudios controlados, correctamente diseñados para lograr avances en éste nuevo campo de la investigación equina.

Apartados presentes en el trabajo de investigación

 ¿Que son las células madre?
 ¿Que es la ingeniería de los tejidos?
 Revisión de la bibliografía
 Consideraciones generales y comparativas de las terapias basadas en células madre
 Terapias mas comunes con células madres en equinos
 Terapias basadas en andamiaje en general
 Terapias de andamiaje simple
 Terapias de andamiaje complejo
 Tratamiento con biofactores y terapia génica
 Almacenamiento a largo plazo de células madre y tejidos obtenidos mediante ingeniería
 Consideraciones sobre seguridad de las terapias con células madre
 El caballo como modelo animal de estudios con células madre y tejidos de ingenieria